Αντικείμενο του έργου αποτελεί η ανάπτυξη και προτυποποίηση ενός νέου διαγνωστικού γενετικού τεστ, με εμπορικό όνομα SHINE (Screening for HPV–Induced Neoplasia and Epigenetics Early detection), βασισμένου στη μελέτη και συνδυασμό πέντε επιγενετικών δεικτών υπερμεθυλίωσης) για καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία τραχήλου της μήτρας, cervical intraepithelial neoplasia, CIN) με q methylation –specific PCR (qmSP), σε δείγματα ελάχιστα επεμβατικής λήψης (κλινικής και αυτοδοκιμαστικού ελέγχου-αυτολήψης). Το τεστ προορίζεται να ενισχύσει τη μοριακή διάγνωση [μέσω των τύπων του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (high risk Human Papilloma Virus–hrHPV)] σε συνδυασμό και με την κυτταρολογική εξέταση, μεθοδολογία η οποία προς το παρόν έχει μεγάλους περιορισμούς, λόγω υπερδιάγνωσης. Στόχος είναι η άσκοπη προώθηση σε επεμβατικές μεθόδους, που με τη σειρά τους και πάλι υστερούν ευαισθησίας, ειδικότητας και δεν μπορούν να προσφερθούν στο σύνολο του πληθυσμού.
Ο σχεδιασμός του SHINE στοχεύει στην ανάπτυξη, κλινική αξιολόγηση, επικύρωση και προτυποποίηση της εξέτασης σε συνδυασμό με διαγνωστικό αλγόριθμο μιας επιγενετικής εξέτασης, η βιομηχανική αξιοποίηση της οποίας θα την εξελίξει από διαγνωστική υπηρεσία σε εμπορικό κιτ σε εθνικό και ευρωπαϊκό επίπεδο.
Ανάπτυξη και επικύρωση του νέου τεστ μεθυλίωσης DNA για HPV
Το νέο τεστ ανάλυσης της μεθυλίωσης αναπτύσσεται χρησιμοποιώντας την τεχνολογία ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Ειδικής για τη Μεθυλίωση (Quantitative Methylation–Specific PCR– qMSP). Μέσω του σχεδιασμού ειδικών εκκινητών για το μεθυλιωμένο DNA θα προσδιορισθεί η μεθυλίωση πέντε γονιδίων-στόχων αναφορικά με τη μη μεθυλίωση των συγκεκριμένων περιοχών του DNA στο γονίδιο αναφοράς.
Συγκεκριμένα, η μεθοδολογία περιλαμβάνει τα εξής στάδια:
1. Σχεδιασμός των ειδικών εκκινητών ( primers) για τα πέντε γονίδια στόχους
2. Απομόνωση και τροποποίηση του DNA.
3. Ειδική για μεθυλίωση ποσοτική PCR.
4. Προτυποποίηση κατά iso 15189
5. Μελέτη ανταπόκρισης των γυναικών στην αυτολήψη και κλινική μελέτη επιβεβαίωσης του SHINE.
Ο αρχικός έλεγχος της μεθοδολογίας χρησιμοποιεί θετικούς και αρνητικούς για τη μεθυλίωση μάρτυρες. Ως θετικός μάρτυρας μεθυλίωσης, σε κάθε δοκιμή θα χρησιμοποιηθούν διαδοχικές αραιώσεις in vitro μεθυλιωμένου γονιδιωματικού DNA με μεθυλτρανσφεράση Sss I (CpG). Ως αρνητικός μάρτυρας μεθυλίωσης θα χρησιμοποιηθεί H2O και ενισχυμένο πλήρες γονιδίωμα DNA από λευκοκύτταρα (Whole Genome Association, WGA).
Στη συνέχεια θα πραγματοποιηθεί σύγκριση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από το νέο τεστ σε σχέση με εγκεκριμένα τεστ (Fujirebio, PreCursor-M+FAM19A4/miR124-2 methylation analysis) σε hrHPV-θετικές γυναίκες σε προκαρκινικό στάδιο (CIN2/3) καθώς και με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Θα υπολογιστεί η ευαισθησία και ειδικότητα της ανάλυσης σε σχέση με το εγκεκριμένο kit. Αρχικό στόχο του προγράμματος SHINE αποτελεί η διαπίστευση EN ISO 15189 του τεστ ξεκινώντας με τα δύο γονίδια (FAM19A4/miR124-2).
Με σκοπό την επιβεβαίωση του SHINE θα πραγματοποιηθεί κλινική μελέτη σε γυναίκες με hrHPV / CIN2/3. Η κλινική μελέτη θα αποτελέσει την επικύρωση του έργου και θα συμπεριλάβει την επιβεβαίωση της μεθόδου σε περισσότερα δείγματα ασθενών (real world data). Παράλληλα, θα πραγματοποιηθεί και μελέτη ανταπόκρισης των γυναικών στην αυτολήψη. Συγκεκριμένα θα γίνει ενημέρωση για την πρόληψη της λοίμωξης από τον ιό HPV που αποτελεί βασικό μέρος της σεξουαλικής υγείας και ευημερίας. Με στόχο την ευκολότερη πρόσβαση στη διάγνωση και την πρώιμη ανίχνευση λοιμώξεων, θα υπάρξει εξοικείωση των γυναικών στη διαδικασία αυτολήψης ώστε να αναζητήσουν άμεση ιατρική βοήθεια, προστατεύοντας τόσο τον εαυτό τους όσο και τους συντρόφους τους.
Δημιουργία οδηγού στην κλινική πράξη
Η μελέτη του βιολογικού μηχανισμού της μεθυλίωσης του DNA και ο ρόλος της στην καρκινογένεση αποτελεί ένα πρόσφατο αλλά ιδιαίτερα σημαντικό ερευνητικό πεδίο μελέτης το οποίο έχει τεκμηριωθεί συστηματικά τα τελευταία χρόνια.
Ειδικά στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, τα τεστ μεθυλίωσης παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς μπορούν να συμβάλουν στην άμεση αναγνώριση αλλοιώσεων υψηλού βαθμού (CIN) και στον καλύτερο διαχωρισμό των γυναικών με HPV λοίμωξη που διατρέχουν αυξημένο κίνδυνο εξέλιξης σε κακοήθεια. Τα πρώτα διαθέσιμα εμπορικά τεστ βασίζονται σε περιορισμένο αριθμό βιοδεικτών, ωστόσο τόσο η διεθνής βιβλιογραφία όσο και τα κλινικά δεδομένα καταδεικνύουν την ανάγκη περαιτέρω βελτίωσης και εμπλουτισμού τους, ώστε να αυξηθεί η διαγνωστική τους ακρίβεια και η κλινική τους χρησιμότητα.
Το SHINE έρχεται να καλύψει το συγκεκριμένο κενό, καθώς θα βασίζεται σε 5 γονίδια-στόχους, διεκδικώντας μία θέση στην αγορά και στη διαγνωστική πρακτική. Ο διαγνωστικός αλγόριθμος, που εφαρμόζεται πιλοτικά ακόμη με τη χρήση μόνο δύο γονιδίων, θα χρησιμοποιηθεί ενισχυμένος ως εξέταση -SHINE, τοποθετώντας την σε καίριο σημείο της διάγνωσης του τραχήλου της μήτρας. Το προτεινόμενο διάγραμμα χρήσης του τεστ μεθυλίωσης, όπως απεικονίζεται παρακάτω, δείχνει ευκρινώς μία σημαντική θέση του τεστ στη διαγνωστική πρακτική.
